染色した検体を懸濁して測定するまでの注意点 [FACS]

2023年1月11日2023年1月15日

今日は染色した細胞を懸濁して、サイトメーターに持っていくまでに注意する点について解説します。原則、臨床検査技師の方・血液内科医師・医生物学的な研究をする研究者を、想定聴衆として書きます。皆様に役に立つ内容ではないものの、日本語での情報は不十分だと感じてます。今後の日本発のサイトメトリーの臨床・研究のスタンダードが上がることを祈念しながら、医学者ナカノが解説していきます

本日の結論：

サンプル懸濁に使われるバッファーには、
細胞接着に必要な2価イオンをキレートするEDTAや、
細胞を長生きさせるための蛋白(BSA/FBS)などを添加しているものが多いです
セルソートする場合フェノールレッド抜き・HEPES添加・清潔操作をオススメします
チューブはポリスチレンとポリプロピレンの2種類があります
ポリスチレンのほうが多くのサイトメーターで使えます
細胞がくっつきやすい場合、測定前にセルストレイナー使用をオススメします

検査・実験検体は、

検査や実験に使う細胞全般で、通常は電解質・pH・浸透圧・蛋白量・温度などをよく管理された培地ないしFACS bufferに懸濁されていると思います。Ficollとの接触・溶血操作・Wash・遠心分離・ピペッティングなどがすべて結果に影響するので、臨床・研究を問わず一定の品質を保ちたいところです

フローサイトメトリー用のサンプル調製の注意点は、

BSA/FBSなどの蛋白は生きている細胞を扱う場合、添加することをオススメします
細胞接着に2価陽イオンが必要なのでMg²⁺・Ca²⁺なしのバッファーを使うとよいです
また、EDTAが添加されているとMg²⁺・Ca²⁺をキレートできるのでEDTA入りを選ぶのも手です
フェノールレッドは蛍光特性があるので、添加されていない無色の培地を使うほうが良いです
接着しやすい細胞の場合はセルストレイナ―(30～35μm)が推奨されます
細胞が生きている場合は代謝を落とすために測定まで氷上に置いておくのがよいですが、
好中球のように冷やすと活性化して死ぬ細胞もあるので、検体次第の部分があります

セルソートする場合には

長時間低CO₂に晒されると炭酸緩衝液ではpHが上昇してしまうので、
HEPESを添加してpHを保つ(炭酸じゃない緩衝液を使う)ことがオススメです
セルソート後に培養を継続する場合に清潔操作に気をつける必要があります

懸濁する体積は

サイトメーターが1秒あたりに処理できるイベント数
サイトメーターが1分辺りに処理できるサンプル容量の概算
サイトメーター内で計測されずに無駄になってしまう分の容量

などを勘案して決定します。
サイトメーターは処理できるイベント数を超えると、Abortion rateなどの数値で処理落ちしていることを知らせてくれます。その場合余分にFACS bufferを持参してそのまま薄めることで対処が可能です。例えば1分あたり30μL処理できる場合、300μLで懸濁すると1本あたり10分近くかかります。一方で、例えば50μL無駄にするサイトメーターを使っている場合、200μLで懸濁すると25%の検体が測定されないことになるので、容量を増やしたほうが良いといえるでしょう