フローサイトメトリーの蛍光色素の特徴 [FACS]

フローサイトメトリーで使われる蛍光色素について詳しく解説します。原則、臨床検査技師の方・血液内科医師・医生物学的な研究をする研究者を、想定聴衆として書きます。皆様に役に立つ内容ではないものの、日本語での情報は不十分だと感じてます。今後の日本発のサイトメトリーの臨床・研究のスタンダードが上がることを祈念しながら、医学者ナカノが解説していきます

本日の結論：

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言葉の解説をします

古典的な蛍光色素とは、

例えばFITC, PE, APC, PerCP, Pacific Blue, AmCyanなどがそれに該当します
Alexa Fluorも色々な色素が販売されていますがタンデム色素ではありません
古典的な蛍光色素は安定しているものの、単体だと光のスペクトラムをフル活用できないという欠点があり、タンデム色素やポリマー色素が開発されるに至りました

ポリマー色素は、

• 2010年代以降に開発された新しい蛍光色素です
• ポリマー色素の名前はBUV・BV・BB・SBなどで始まります
  • BUV(Brilliant UV)・BV(Brillant Violet)・BB(Brillaint Blue)・SB(Super Bright)

最初に開発されたBrilliant VioletはVioletレーザーで励起される一連の色素で、BV421・BV480・BV510以外はすべてBV421のタンデム色素です。タンデム色素とは言え組成がポリマーなので、比較的安定であるとされています

タンデム色素とは、

• レーザーに励起される色素とFRETにより活性化される色素を組み合わさったものです
• PE/Cy7やAPC/Cy7は安定性が低くロット・紫外線・温度の影響でCy7が解離して、
• PE, APCとして認識されてしまう可能性があるというのが注意すべきです
• 一連の実験を別ロットの抗体で実施するのはオススメしません

抗体の残りが少なくてロットが別の抗体を使用する場合、事前に同一型番別ロットの抗体同志を混ぜて、コントロール・サンプルなどをすべて同一の条件で染色できるように工夫します

FRETとは、

• Förster resonance energy transferの略で、
• ドナー分子からアクセプター分子にエネルギーを渡すことです

例えば下の図はCFP→YFPのFRETを示したものです。CFPとYFPが十分に近い距離(100Å(オングストローム)以内)の時に、CFPが受け取ったエネルギーをCFPの青色の光を放射することなく、YFPを励起してYFP固有の黄色い光が放射されます。Emission(放射)のピークがずれることをストークスシフトといいます

ポリマーとタンデム色素の分類は、

	ポリマー色素	非ポリマー色素
タンデム色素	その他大勢	PE・PerCP・APCが先頭につくそれ以外の蛍光色素
非タンデム色素	BUV395・BV421・BV480・BV510・SB436・BB515	PE・PerCP・APC・FITC・Pacific Blue・Pacific Orange・AmCyan・Alexa Fluor・各種蛍光蛋白(GFPなど)

覚え方は、

• ポリマー非タンデムのBUV395・BV421・BV480・BV510・SB436・BB515と、
• 非ポリマータンデムは先頭がPE・PerCP・APCから始まる

だけ覚えたら大体把握できると思います

ポリマー系タンデム色素一覧

ドナー	タンデム色素
BUV395	BUV496・BUV563・BUV661・BUV737・BUV805
BV421	BV570・BV605・BV650・BV711・BV750・BV785
SB436	SB600・SB645・SB702・SB780
BB？	BB630・BB660・BB700・BB755・BB790

ポリマー系の非タンデム：BUV395・BV421・BV480・BV510・SB436・BB515
ポリマー系はBUV/BV/SB/BBなどの略称があるので判別しやすいです
Brilliant Blueのドナー分子は2023年時点では非公開です

非ポリマー系タンデム色素一覧

ドナー	タンデム色素
PE	PE-eFluor610・PE/Dazzle594・PE-TexasRed・PE-CF594・PE-Vio615・PE-AF610・PE/Fire640・PE-Cy5・PE-AF700・PE-Cy5.5・PE/Fire700・PE-Cy7・PE-Vio770
PerCP	PerCP-Cy5.5・PerCP-eFluor710・PerCP-Vio700
APC	APC-Cy5.5・APC-AF700・APC-R700・APC-AF750・APC-C750・APC-Cy7・APC-H7・APC-eFluor780・APC-Vio770・APC/Fire750・APC/Fire810

ポリマー色素は使用上の注意点は、

• 2つ以上のBV・BUV・BB・SBを使用するときはポリマー色素染色試薬が必要なことです
• Brilliant Stain Buffer Plusがオススメです
• Fc Blockingと同じタイミングでしましょう

ポリマー色素は色素同士が結合しやすいことがわかっており、2つ以上のBV・BUV・BB・SBを使用するときはBrilliant Stain BufferやSuper Bright Complete Staining Bufferを使用するように推奨されています。多くの場合はBrilliant Staining BufferはFc Blockingと同時に実施されています。抗体のTitrationは単一の抗体なのでFc Blockingだけで良いです
3DナカノはSuper Brightを使ったことがありません。複数ポリマー色素染色試薬はメーカーによって効き目に差があるようなので、3DナカノはBDのBrilliant Stain Buffer Plusを使っています。Plusがついていない方は添加する量が多く、肝心の抗体が希釈されてしまいます。3DナカノはBrilliant Stain Buffer Plus一択です

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タンデム色素の使用上の注意点は、

• ドナー色素に必ず漏れ込みがあるので、検査・実験の度に単染色コントロールが毎回必要です
• 光・温度・酸化に敏感なので、露光・温度変化などを避けるほうがよいです
• 固定する場合30分以内にすることが推奨されています
• ゲーティング(細胞集団の陽性・陰性の判断)には、FMOを使用することが推奨されています

FMOコントロールについては長くなるので別の記事で扱います

単球・マクロファージなどに食されやすい色素とは、

• PE/Cy5・PE/Cy7・PE/Dazzel594・APC/Fire750・APC/Cy7・PerCP/Cy5.5などです
• これらの色素は抗体の特異性にかかわらず、
• 単球・マクロファージなどに結合する恐れがあるとされています

Biolegend社ではFcレセプターのブロッキングで対処できない現象を解決すべくTrue-Stain Monocyte Blockerを発売しています。3Dナカノが必要になったことはないのですが、知っていてもいい知識だと思ったのでシェアします

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蛍光蛋白(Fluorescent protein)の特性は、

• fpbase.orgを見るのが一番よいです
• 蛍光蛋白の開発の歴史・アミノ酸配列・光学的な特性など多くの情報が得られます

FPbase

FPbase: The Fluorescent Protein Database FPbase is a free and open-source, community-editable database for fluorescent proteins and their properties.

まとめ：

本日のフローサイトメトリーで使う蛍光色素の基礎知識はいかがでしたか。3Dナカノはそうと知らずにBrilliant Staining Bufferなしで実験をしていたことがあるので無知は怖いと思いました。読んでも不明な点は質問をお寄せください。自信を持って正しい結果を出せるように頑張っていきましょう！